將反應(yīng)管放入PCR儀中，啟動PCR程序，設(shè)定初始溫度和PCR循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。PCR儀會按照預設(shè)的溫度范圍，在反應(yīng)管中設(shè)置不同梯度溫度，并在每個梯度區(qū)域完成相應(yīng)的PCR循環(huán)。收集PCR產(chǎn)物并進行后續(xù)分析。
1、首先在PCR儀中設(shè)定程序：一般是94度變性5min，之后“94度變性、退火（不同引物溫度不同）、72度”延伸共30-35個循環(huán)，再72度延伸10min，最后hold16度即可。
2、在PCR儀軟件界面上選擇梯度功能，并輸入需要控制的溫度范圍。將所需擴增的樣本加入反應(yīng)管中，注意樣本應(yīng)該保持相同體積和濃度。將反應(yīng)管放入PCR儀中，啟動PCR程序，設(shè)定初始溫度和PCR循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。
3、以上都確定了之后，我建議你設(shè)計一下touchdown程序（每個循環(huán)降0.5度，這個具體程序你去查查，既可以減少非特異擴增，而且不用摸退火溫度條件）。你還可以摸摸溫度梯度咯。
1、，核酸電泳儀、電泳槽（電泳槽最好專用）7，RNase free的各式槍頭、5ml離心管；RNase free的雙蒸水。8，如果樣品不會立即進入下一步實驗，建議具備超低溫冰箱。
2、如果僅僅是跑一個PCR+檢測的話，設(shè)備如下（一套）：PCR儀，價格：5W左右；凝膠成像系統(tǒng)，價格：8-10W；電源、電泳槽、電腦、一套加樣器（槍）、2W左右。這只是最基礎(chǔ)的設(shè)備。PCR檢測、分子標記等實驗足夠了。
3、金屬制品：水龍頭、樣品匙（藥勺）、坩堝鐵架臺、滴定臺、試管架、坩堝鉗、酒精噴燈、夾子、鑷子、實驗剪刀、升降臺、本生燈等。
4、高壓過的超純水，高壓滅菌過的藍色、白色和黃色槍頭，100ul、500ul和1ml離心管，大量的話需要排管（12連管），放置離心管用的的架子（96孔板等）。PCR最好在冰上進行，所以準備冰盒。
5、微生物檢測實驗室的建設(shè)基礎(chǔ)要求是墻壁表面必須光滑防水耐腐蝕，地面無滲漏，光潔但不滑，儀器和設(shè)備的陳設(shè)簡潔，方便打掃、便于消毒清潔，讓實驗環(huán)境盡量保持(潔凈)無菌狀態(tài)。
體系過大會導致整個反應(yīng)體系升溫不勻，特別是體系中心溫度和持續(xù)時間都少于靠近管壁的部分，會造成特異性條帶增多或彌散的現(xiàn)象。一般建議反應(yīng)體系不要超過100微升。
相應(yīng)數(shù)值，有 Std“1～100ul”和 9600“1~50ul”兩檔可供選擇。按 F1“Start”啟動 按“INFO”對應(yīng)鍵查看 PCR 結(jié)束鍵。擴增完成后按臺面左方“Stop”鍵退出。按“Hist”，可查看上次擴增的歷史記錄。
按照體系配方在冰上的Rnasefree的滅菌PCR管中配置Templateprimer mix，總體系13ul。本實驗是聯(lián)合使用anchored oligo dT引物和隨機六聚體引物進行的反轉(zhuǎn)錄。
，ABI Step one plus(fast模式）這些體系是不一樣的。如你所說，如果儀器的最大體系是20UL的話，用50UL來跑是有問題的；如果儀器的最大體系是50UL，用20UL的體系來跑是可以的（只是損失一點靈敏度和熒光值）。
離心管不一定是PCR管，離心管按照其容量分好多種，常用的有5ml，2ml，5ml，15或者50ml，最小的一種（250ul）可作為PCR管使用。
反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
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